本发明涉及用于培养Thraustochytriales属微生物的最适化方法,按照该方法将微生物培养在不添加钠盐和氯盐并且总盐含量少于3.5g/L(相当于少于海水盐含量的10%)的低盐培养基中,随后从微生物和/或培养基中分离PUFAs。本发明特别涉及具有大大降低的总盐含量,尤其是特别降低的NaCl含量的新的最适化培养基。通过使用不同盐类的新的组合物作为培养基的成分,可以极大地增加并显著简化PUFAs的生产,而这种培养基中离子的总重量比率不超过1.75g/L。此外,在优选情况下该培养基中完全不添加钠盐和氯盐,这有助于防止由含有盐的废水所引起的环境破坏。
1.一种培养裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物的方法,其中将微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,其中的微生物每干生物质产生多于10%的DHA,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0。
2.权利要求1的方法,其中向培养基中加入最多3g/Lxa0CaCO₃。
3.权利要求1或2的方法,其中的微生物每干生物质产生多于14%的DHA。
4.权利要求1-3任何一个的方法,其中的微生物每干生物质产生多于5%的DPA。
5.权利要求1-4任何一个的方法,其特征为发酵培养基的总盐含量在小于海水盐含量的8%的范围内。
6.权利要求1-5任何一个的方法,其特征为发酵培养基的总钠含量少于150mg/L。
7.权利要求1-6任何一个的方法,其特征为发酵培养基的总氯含量少于250mg/L。
8.权利要求1-7任何一个的方法,其特征为发酵培养基含有葡萄糖、酵母提取物、硫酸镁、碳酸钙和磷酸钾。
9.权利要求1-8任何一个的方法,其特征为发酵培养基含有葡萄糖、玉米浆、硫酸镁、碳酸钙和磷酸钾。
10.权利要求8或9的方法,其特征为发酵培养基含有的硫酸镁、碳酸钙和磷酸钾每种少于3g/L。
11.权利要求1-10任何一个的方法,其特征为发酵培养基的pH值在3到10之间。
12.权利要求1-11任何一个的方法,其特征为培养在10°C和40°C之间进行。
13.权利要求1-12任何一个的方法,其特征为培养进行1到10天。
14.权利要求1-13任何一个的方法,其特征为微生物是Ulkeniaxa0sp.SAM2179。
15.权利要求1-13任何一个的方法,其特征为微生物是Schizochytriumxa0sp.SR21。
16.含有至少10%DHA的油,其能通过如下步骤获得:a)将裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于
1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0,b)从所述微生物获得生物质和/或培养液,以及c)从培养液和/或其中含有的生物质中分离油。
17.含有至少5%DPA的油,其能通过如下步骤获得:a)将裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl-离子的重量分数之和少于
1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0,b)从所述微生物获得生物质和/或培养液,以及c)从培养液和/或其中含有的生物质中分离油。
18.含有生物质的动物饲料,通过将裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,以及从所述微生物产生生物质,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0。
19.含有生物质的人类营养食品,通过将裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,以及从所述微生物产生生物质,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0。
20.从裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物生产油的方法,所述微生物表现出每干生物质产生多于10%的DHA,其特征为,a)将微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为
12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0,b)从所述微生物获得生物质和/或培养液,以及c)分离生物质和/或培养液中所含的油。
21.从裂壶菌(Schizochytrium)或Ulkenia属的微生物生产多不饱和脂肪酸的方法,其特征为,a)将微生物培养在不添加钠盐和氯盐的发酵培养基中,其中Na⁺和Cl^-离子的重量分数之和少于1.75g/L并且总盐含量少于3.5g/L,所述发酵培养基中单水葡萄糖的浓度为56.25g/L,酵母提取物的浓度为
12.5g/L[Difco],pH值调整到6.0,b)从所述微生物获得生物质和/或培养液,c)分离生物质和/或培养液中所含的油,以及d)从所获得的油分离其中所含的多不饱和脂肪酸。
22.权利要求21的方法,其中多不饱和脂肪酸是DHA。
23.权利要求22的方法,其中DHA的纯度为至少90%。
24.权利要求23的方法,其中多不饱和脂肪酸是DPA。
25.权利要求24的方法,其中DPA的纯度为至少90%。各种不同的PUFAs(多不饱和脂肪酸),特别是ω-3脂肪酸(n-3脂肪酸)是人类营养的必需成分。然而,已知在大多数工业化国家中,n-3脂肪酸的供给是不足的。与此相反,饮食中的总脂肪比例,以及饱和脂肪酸和n-6脂肪酸的摄入太高。这是由于我们的饮食结构发生的变化,特别是在最近的大约150年间发生的变化所引起的,并与各种不同的文明化所带来的慢性病,例如工业化国家主要的死亡原因——心血管疾病的出现相关联(Simopoulos,A.P.,1999,Am.J.Clin.Nutr.70,560-569)。同时,大量的研究显示,通过定向地增加n-3脂肪酸,特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的摄入,有可能显著降低心血管病的风险(GISSI-Prevenzione研究人员(Gruppoxa0Italianoxa0perxa0loxa0Studioxa0dellaSopravvivenzaxa0nell′Infartoxa0miocardico),1999,在心肌梗塞后通过饮食补充n-3多不饱和脂肪酸和维生素E:GISSI-prevenzione试验的结果,Lancet354,447-455;Burr等,1989,脂肪、鱼类和纤维摄取量的变化对死亡和心肌梗塞的影响:饮食和再次梗塞试验(DART),Lancetxa02,757-761)。因此,许多不同的组织(WHO、FAO、AHA、ISSFAL、不列颠营养基金会等)推荐大量增加n-3脂肪酸的摄入量(Kris-Eherton等,鱼类消费量、鱼油、ω-3脂肪酸和心血管疾病,Circulationxa02002,2747-2757)。生产PUFAs以及特别是n-3脂肪酸的源泉为上述所有的海洋冷水鱼类以及从它们中提取的油,此外还为海洋微生物,这些海洋微生物与鱼类相比的优势在于,它们可在成本效应和受控条件下进行发酵以生产PUFAs。发酵生产不存在任何污染的危险,而对于鱼类或从其中提取的鱼油来说却经常被描述发生这样的问题(Olsenxa0SF.Intxa0Jxa0Epidemiol.2001:1279-80)。此外,提取的鱼油的成分必然会受到对鱼的种类和培养条件的选择的影响,而不易受到季节变化的影响,正如对于鱼类和鱼产品所描述的那样(Gamez-Mezaxa0etxa0al.Lipidsxa01999:639-42)。已经发现了许多适合于生产n-3PUFA的微生物,例如弧菌(Vibrio)属的细菌(例如海产弧菌(Vibrioxa0marinus))或甲藻(Dinophyta),特别是隐甲藻(Crypthecodinium)属中的微生物例如寇氏隐甲藻(C.cohnii),或原生藻菌例如Pinguiophyceae中的微生物例如Glossomastix、Phaeomonas、Pinguiochrysis、Pinguiococcus和Polydochrysis。优选的用于发酵生产PUFA的微生物属于Stramenopiles(或Labyrinthulomycota),特别是Thraustochytriales目(Thraustchytriidea)中的微生物,又特别是Japonochytrium、裂壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、Althornia、Labyrinthuloides、Aplanochytrium和Ulkenia属中的微生物。已经知道一些上面提到的微生物可以用于工业化生产脂肪酸,相应的工艺方法已经被描述。因此,国际专利申请WO91/07498A1公开了使用破囊壶菌和裂壶菌属的生物体来生产PUFAs。WO91/11918A1公开了使用寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumxa0cohnii)生产PUFAs,WO96/33263A1和相应的欧洲专利申请EP0823475A1描述了使用裂壶菌属的微生物生产PUFAs,而专利申请WO98/03671公开了使用Ulkenia属的微生物生产PUFAs。上面描述的微生物特别是网粘菌门(Labytinthulomycota)的自然栖息地是海洋栖息地。因此,这些微生物通常培养在含盐的培养基中,对本发明来说,海水的盐浓度被定义为32-35g/L,和90-95%含量的钠和氯。用于培养海洋微生物例如破囊壶菌或裂壶菌的典型培养基是基于海水(例如ATCC(美国典型培养物保藏中心)的790By+培养基[酵母提取物1.0g,蛋白胨1.0g,D+葡萄糖5.0g,海水1L])。但是,也已经知道Thraustochytriales目的微生物可以在具有非常低盐度的培养基中存活。但是,当盐含量低于7.5-15g/L的限度,对应于盐度7.5-15‰时,它的生长被描述为只是非常低,在低盐度范围内没有中间最大值。最适生长速度只在高于上面提到的盐度限度时才能获得(Fan等,BotanicaMarinaxa045,2002,50-57页)。然而对于广盐性微生物的商业化发酵来说,已经描述了使用大约50-60%低盐含量的海水。按照Henderson的“生物学术语字典”,广盐性生物是指那些能够调整自身适应广范围盐含量的生物(Hendersonxa0W.D.,Lawrence,E.,Henderson生物学术语字典(Henderson’sxa0dictionaryxa0ofbiologicalxa0terms),第十版,1992,173页)。已经描述了属于原生藻菌(Stramenopiles)(或Labyrinthulomycota)的广盐性微生物可以在含有低量钠离子(60%的海水)的发酵培养基中生产较大量的PUFA(美国专利No.6,451,567)。此外也描述了低氯含量培养基的使用,其目的是为了降低氯对发酵设备的腐蚀作用(美国专利No6,410,281)。有报道对于例如破囊壶菌和裂壶菌属的微生物来说,使用了所含氯浓度低于3g/L的发酵培养基(美国专利Pat.No5,340,742,美国专利No6,451,567,美国专利No6,410,281)。也已经知道培养也可能在与盐水相比盐含量较低的条件下进行。具体的参考文献参见专利文件WO98/03671A1、EP0823475A1、美国专利No6,451,567、美国专利No6,410,281。此外还知道对于裂壶菌属的微生物(Schizochytriumxa0sp.S31;ATCC20888)的发酵来说,脂肪酸相对产量的最大值在氯化钠浓度为1.75g/L时获得。其中使用的盐的总量不到海水盐含量的10%,但是主要包含钠和氯离子(EP0512997B1和美国专利No5,518,918)。但是,到目前为止所有描述的方法都有缺点。发酵工艺的效率特别受到可达到的生物质和单位生物质的产物含量的限制。此外,产生的油可能部分以不一定对应于所需产物的脂肪酸形式存在,而必须首先对工艺进行修饰。某种程度上在单位生物质的产物含量低的情况下,加工通常是复杂的,因为为了获得相对少量的产物必须对相对大量的生物质进行加工。此外,上面描述的所有方法都在培养基中包含了相对高的总盐含量。这不仅会在产品处理过程中导致大量的问题,而且表现出极端的环境劣势,因为不仅产生了大量的生物质,而且产生了含有大量盐的废水,它们必须被处理。因此,根据本技术领域的现状,本发明的一个目的是提供新的、简单和经济的使用含有低盐含量的培养基培养Thraustochytriales的方法。除了成本效应之外,本方法还应该易于实施,并能够高产高纯度的PUFAs或含有PUFA的产品。该任务以及其它虽没有明确地描述但可以从引言所讨论的关系中毫不费力地得出或推演出的任务,可以通过在本发明的权利要求中限定的目标来实现。权利要求1中限定的方法提供了一种有优势的培养Thraustochytriales的方法。该方法包括将Thraustochytriales目的微生物在不添加固体或溶液形式的钠或氯离子的低盐培养基中培养,该培养基的总盐含量与海水相比少于10%,即总盐含量少于大约3.5g/L。本发明还包括了生产高纯度PUFAs的方法。按照本发明,优选的PUFAs是DHA、DPA和EPA。具体来说,通过上述方法培养的微生物表现出大于10%,优选情况下大于14%,更优选情况下大于18%DHA/干生物质的产量。具体来说,通过上述方法培养的微生物表现出大于5%,优选情况下大于7%,更优选情况下大于10%DPA/干生物质的产量。通过在培养后从微生物(生物质)和/或培养基中分离PUFAs,可以获得高产量和高纯度的PUFAs。此外,本发明提供了生产生物质的方法,其中生物质是通过本发明的培养方法提供的。该生物质可以以所有可以想象得到的方式使用。具体来说,该生物质可以以例如干燥的形式(干生物质)使用,直接作为食品或动物饲料使用。此外,本发明还包括油状的形式,它是通过实施本发明的培养方法,然后从微生物(生物质)和/或培养基中分离该油状物而获得的。具体来说,这是除了许多其它优选应用之外,可以方便地用于人类营养的油状物。在本发明的条件下,微生物每单位重量干生物质表现出大于30wt%,优选情况下大于35wt%油状物的产量。根据本发明,油状物被理解为含有至少70%中性脂和至少2%磷脂,与本领域的专业人员所熟知的正常Thraustochytriales脂肪酸形式相一致。其中的中性脂含有至少80%的甘油三酯和其它化合物例如二酰基甘油、甾醇等。此外,甘油三酯的重量分数包括大约95%脂肪酸和5%甘油。在相当于不到10%典型海水盐含量的如此低盐浓度下发酵海洋微生物的可能性,特别是可完全免除添加在海水中占支配地位、一般来说占海水中可用离子的大约90%的Na⁺和Cl^-离子这个事实,是绝对令人吃惊的。令人吃惊的是,不仅发酵本身是可能的,而且当使用本发明的低盐培养基时,生物质中的PUFA比例显著提高了。更令人吃惊的是,这种效应不仅补偿而且超出了生物质产量的轻微降低(实施例2)。与在培养基1(50%海水盐含量)中进行的对比发酵相比,单位干生物质的主要PUFA——DHA的比例增加了10%以上。较高的产物浓度和较低的盐污染使得产品的加工简化,所有这些在总体上提高了空间-时间产量。在本发明以前,没有已知的发酵工艺可用于在Thraustochytriales目的微生物中使用如此低盐浓度并且不添加钠和氯的培养基来生产n-3脂肪酸。PUFAs是多不饱和长链脂肪酸,链长大于C12,含有至少两个双键。可以按照本发明的方法生产的PUFAs具体来说是n-3脂肪酸和n-6脂肪酸。在本发明中,n-3脂肪酸(ω-3脂肪酸)被理解为多不饱和长链脂肪酸,链长大于C12,含有至少两个或以上双键,其中第一个双键位于从烷基末端开始的C3和C4碳原子之间。因此,对于n-6脂肪酸来说,第一个双键位于从烷基末端开始的C6和C7碳原子之间。属于Labyrinthulomycota组的微生物被考虑用于按照本发明的方法生产PUFAs。Thraustochytriales(Thraustchytriidea)目的微生物是优选的(Lewis,T.E.,Nichols,P.D.,McMeekin,T.A.,Thraustochytrids的生物技术潜力,海洋生物技术,1999,580-587页;和Porter,D,原生生物手册中的网粘菌门:动物、植物和真菌之外的真核微生物及其后裔的结构、培养、栖息地和生活史:藻类、纤毛虫、有孔虫、sprorozoa、水霉和其它原生生物指南。Margulis,L,Corliss,J.O.,Melkonian,M.和Chapman,D.J.主编,McKhann,H.I.协编,Jonesxa0andxa0Bartlettxa0Publishers,ISBNxa00-86720-052-91990,388-398页)。特别优选的是Japonochytrium、Labyrinthuloides、Aplanochytriumxa0Althornia、裂壶菌、破囊壶菌和Ulkenia属的微生物。其中,裂壶菌、破囊壶菌和Ulkenia是最特别优选的。特别优选的是:Japonochytriumxa0sp.ATCCxa028207,Thraustochytriumxa0aureum(特别是ATCCxa028211和ATCCxa034304),Thraustochytriumxa0roseumxa0ATCCxa028210,Thraustochytriumxa0sp.ATCCxa020890、ATCCxa020891、ATCCxa020892和ATCC26185,Schizochytriumxa0aggregatumxa0ATCCxa028209,Schizochytriumxa0sp.ATCC20888和ATCCxa020889,Schizochytriumxa0SR21,以及Ulkeniaxa0sp.SAMxa02179和SAMxa02180。适合用于本发明的方法的微生物可以是野生型的,也可以是突变体和从它们衍生的菌株以及相应生物的重组菌株。本发明特别包括了用于提高PUFA产量的突变或重组菌株。本发明的微生物通过用这些生物体的预培养物接种液体或固体培养基来进行培养。适合于Thraustochytriales目的微生物的培养技术对本技术领域的专业技术人员来说是众所周知的。一般但不是绝对地来说,培养是通过在相应的容器中进行含水发酵来完成的。用于这种类型发酵的典型容器的例子包括摇瓶或生物反应器,例如STRs(搅拌釜式反应器)或泡罩塔。培养一般在温度为10°C到40°C之间,优选为20°C到35°C之间,特别优选为25°C到30°C之间,更特别优选为27°C和29°C之间进行,特别是在28°C下进行。在本发明的另一个实施方案中,低盐培养基含有的总盐少于1.5g/L。在本发明的另一个优选实施方案中,低盐培养基的总盐含量相当于海水盐含量值的15%以下,优选情况下相当于12%以下,更优选情况下相当于10%以下。非常特别优选的是总盐含量为海水盐含量的8%以下。在低盐培养基中不添加钠盐。在本发明的低盐培养基中也不添加氯化物盐类。按照本发明,添加意味着以溶解和固体的形式加入。例如,按照本发明,加入海水,即使是最少量的海水,也属于加入了钠和氯盐。在本发明的培养基中加入不常用的培养基成分,如果这些不常用的培养基成分中含有相应的钠或氯离子,也被理解为加入了这些盐。然而,对于本技术领域的专业人员来说很明显的是,常用的(以及最需要的,即必需的)培养基成分水(自来水)、酵母提取物、玉米浆或类似物含有非常少量的、无法避免的钠和氯。因此根据本发明,加入这样的常用培养基成分不被理解为加入了钠和氯盐。例如,酵母提取物含有少于2wt%的NaCl。因此,如果以常用量即10到20g/L之间,在培养基中加入酵母提取物,NaCl含量的增加少于0.2g/L。根据本发明这不被当作添加了NaCl。在具体的优选实施方案中,因此该培养基无钠和/或氯盐的添加。低盐培养基的总钠含量在优选情况下少于2g/L,在优选情况下少于500mg/L,和非常特别优选情况下少于150mg/L。低盐培养基的总氯含量在优选情况下少于2g/L,在优选情况下少于500mg/L,和非常特别优选情况下少于250mg/L。Na离子和Cl离子的重量分数总和在特别优选情况下少于1.75g/L。此外,低盐培养基优选含有一种或多种碳源,以及一种或多种氮源。对于本技术领域的专业技术人员来说,可用做培养Thraustochytriales目的微生物的碳源和氮源的物质是众所周知的。可以使用的碳源例如碳水化合物例如葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麦芽糖、可溶淀粉、岩藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、谷氨酸、糖蜜、甘油或甘露醇、或脂肪和油类或植物水解产物。可以使用的天然氮源例如蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、牛肉提取物、酪蛋白氨基酸、玉米浆或大豆,可以使用的有机氮源例如谷氨酸和尿素,无机氮源例如乙酸铵、碳酸氢铵、硫酸铵或硝酸铵也可以被用做氮源。低盐培养基可以含有本领域的专业技术人员所熟知的能够协助Thraustochytriales目的微生物培养的所有其它成分,特别是例如Ca、Mg、K、Fe、Ni、Co、Cu、Mn、Mo或Zn的无机盐。可以列举的例子有磷酸盐例如磷酸氢钾,或碳酸盐例如碳酸钙,硫酸盐例如硫酸铵、硫酸镁、硫酸铁或硫酸铜。其它可以使用的无机盐例如卤化物,例如溴化钾或碘化钾。在适合的情况下,培养基可以含有添加的大量或微量营养素,例如氨基酸、嘌呤、嘧啶、玉米浆、蛋白水解物、(水溶性和/或水不溶性的)维生素,以及其它本领域的专业技术人员所熟知的培养基成分。如果需要也可以加入消泡剂。培养基可以含有复杂成分,也可以是化学上确定的。每种成分的量可以变化,只要对微生物的生长或生产率没有负面影响就行。本领域的专业技术人员可以根据微生物的需要容易地确定每种情况下所需的成分。一般来说,碳源的添加浓度是50到300g/L,氮源的添加浓度为1到30g/L。在优选情况下,氮的含量依赖于培养基中碳的含量来进行调整。当情况允许的时候,特别优选的低盐培养基除了其它成分例如营养性成分之外,还含有至少一种盐类,该盐从含有硫酸镁、碳酸钙和磷酸钾的组中选择,其中每种盐的添加浓度优选不超过3g/L,特别优选每种不超过1g/L,并且不超过本发明的总盐含量。当硫酸镁、碳酸钙和磷酸钾被添加到培养基中时,这是特别优选的。优选的营养性成分是常用量的葡萄糖、酵母提取物和/或玉米浆以及其它本领域的专业技术人员所熟知的常用营养性成分。培养基的pH值通过加入相应的酸或碱被设定在3到10的范围内,优选为4到8,特别优选为5到7,非常特别优选为6。然后将培养基进行灭菌。对培养基进行灭菌的技术对本领域的专业技术人员来说是熟知的,可以举出的例子包括高压灭菌和除菌过滤。正如本领域的专业技术人员所通常了解的那样,培养可以以分批培养、补料分批培养或连续培养的方式进行。分批培养或补料分批培养进行的时间通常为1到12天,优选为2到10天,特别优选为3到9天。培养基成分可以单独地或作为混合物加入到低盐培养基中,事先制备的混合物也能够使用。培养基成分,特别是碳源和氮源或特别的培养基添加物可以在培养前或培养过程中加入。成分的加入可以重复一次或几次,也可以连续地进行。生产出的PUFA一般为中性脂肪的形式例如三酰甘油,或极性脂的形式例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或磷脂酰肌醇。但是对于本发明来说,术语PUFA、n-3脂肪酸或n-3活性物质被理解为其中可以存在相应脂肪酸的所有可能的形式,即游离脂肪酸以及酯、甘油三酯、磷脂或其它衍生物。所有这些物质都在下文中进行了概述,使用的术语具有同样的意义。此外,在从培养物中分离之前或之后,PUFAs可以通过化学的或生物催化的转酯反应方式进行转化和浓缩,例如在适当的酶(脂酶)的帮助下。从发酵的微生物或培养基中分离PUFAs以及对脂肪酸形式的分析可以使用本领域的专业技术人员所熟知的常用方法来进行[Wanasundara,U.N.,Wanasundara,J.,Shahidi,F.,ω-3脂肪酸浓缩物:生产技术综述,海洋食品一质量、技术和营养药物应用,2002,157-174页]。图1显示了DHA的生产与盐浓度的依赖关系。在本发明的范围内的最大值可以被清楚地看见(数据来自实施例1)。图2显示了生物质和DHA含量与盐浓度的依赖关系。在这种情况下在本发明的范围内的最大值也可以被清楚地看见(数据来自实施例1)。构成了本发明方法的基础的发酵培养基在下文中以一些实施例的方式进行描述。然而,发酵培养基以及本发明并不限于这些实施例。实施例1:培养基中不同的盐量对Ulkeniaxa0sp.SAMxa02179生产PUFA的影响SAMxa02179菌株(Ulkeniaxa0sp.BP-5601;WO9803671)被培养在含有50ml培养基的300ml带有挡板的锥形烧瓶中(温度:28°C,转速:150rpm)。培养基1.DH1培养基单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]Tropicxa0Marin海盐(g/L):16.65[Dr.Bienerxa0GmbH,Wartenberg,Germany]用HCl将pH值调整到6.0培养基2:DH2培养基(不含盐)单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]用HCl将pH值调整到6.0培养基1中的盐(Tropicxa0Marin)以下述的浓度使用:1X(培养基1),0.75X(培养基1.1),0.5X(培养基1.2),0.25X(培养基1.3)以及0.1X(培养基1.4)。在培养48小时后通过离心收获细胞。然后将细胞冷冻干燥并确定干生物质。通过在10%甲醇盐酸中于60°C热处理2小时(同时搅拌)来进行细胞裂解和脂肪酸测定。酯通过气相色谱进行分析以测定脂肪酸成分(Wanasundara,U.N.,Wanasundara,J.,Shahidi,F.,ω-3脂肪酸浓缩物:生产技术综述,海洋食品—质量、技术和营养药物应用,2002,157-174页)。表1:不同的盐含量对发酵参数的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>^*)分别两次实验的平均值。DBM:干生物质;DHA/DBM:单位重量DBM中DHA(二十二碳六烯酸)的重量百分比;g/Lxd以每天每升的克数表示的空间-时间产率;h:小时;CE:对比例表2:不同的盐含量对脂肪酸形式的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>^*)分别两次实验的平均值。14:0肉豆蔻酸;15:0十五烷酸;16:0棕榈酸;DPAω6:二十二碳五烯酸(ω6);DHAω3:二十二碳六烯酸(ω3)从大约50%到0%的海水盐含量开始,对不同浓度的Tropicxa0Marin海盐而言,Ulkeniaxa0sp.SAMxa02179菌株的发酵显示出随着培养基中盐含量的减少,生物质有减少的趋势。但是,在大约5%海水的低盐含量下进行的发酵,令人吃惊地表现出明显的例外。在这里,生物质的产生趋势令人吃惊地表现出中间最大值,再次获得了较高的值。此外,占优势的脂肪酸DHA在干生物质中的比例随着盐酸浓度的降低而增加,并且也在5%海水盐含量时获得最大值,而更低盐含量时又再次降低。对于主要的PUFA-DHA的空间-时间产率而言,这导致在大约5%海水盐含量时获得最大值(参见表1)。该最大值使得DHA的空间-时间产率增加了15%以上。DHA在总脂肪酸中的比例,在大约5%海水盐含量的情况下略微低于较高或较低盐含量的情况(参见表2),但是DHA和脂肪酸或统称的油的总产率正是在这一点处达到其最高水平(参见表1)。基于这些令人吃惊的结果开发了作为本发明目的的低盐培养基。实施例2:使用Ulkeniaxa0sp.SAMxa02179在不同的发酵培养基中生产PUFASAMxa02179菌株被培养在含有50ml培养基的300ml带有挡板的锥形烧瓶中(温度:28°C,转速:150rpm)。培养基1:DH1培养基单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]Tropicxa0Marin海盐(g/L):16.65[Dr.Bienerxa0xa0GmbH,Wartenberg,Germany]用HCl将pH值调整到6.0培养基2:DH2培养基(不含盐)单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]用HCl将pH值调整到6.0培养基3:DH3培养基(含有盐类补充物,无需添加钠和氯):单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]硫酸镁(g/L):1碳酸钙(g/L)1磷酸钾(g/L)1用H₂SO₄将pH值调整到6.0在培养48小时后通过离心收获细胞。然后将细胞冷冻干燥并确定干生物质。通过在10%甲醇盐酸中于60°C热处理2小时(同时搅拌)来进行细胞裂解和脂肪酸测定。酯通过气相色谱进行分析以测定脂肪酸成分。表3:不同的盐含量对发酵参数的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>^*)分别两次实验的平均值。^**)分别三次实验的平均值。本发明的无钠和氯添加的低盐培养基首先被用于浓度大约为10%海水盐含量的发酵中(培养基3)。从其获得的生物质与使用50%海水盐含量的发酵相比略微降低,但是每干生物质的DHA含量较高,从而令人吃惊地导致总体来说相等或甚至增加的空间-时间产率(参见表3)。这对于后面的加工生物质获得DHA的工艺来说相当有优势。因此,这令人吃惊地显示出可在发酵中方便地完全省略掉钠和/或氯(海水中的主要盐类)的加入。实施例3:没有添加钠和氯的培养基中不同的盐量对Ulkeniaxa0sp.SAMxa02179生产PUFA的影响SAMxa02179菌株被培养在含有50ml培养基的300ml带有挡板的锥形烧瓶中(温度:28°C,转速:150rpm)。培养基3:DH3培养基(含有不添加钠和氯的盐类补充物)单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>用H₂SO₄将pH值调整到6.0培养基3中的盐以下述浓度使用:10X含有每种10g/L,2X含有每种2g/L,1X含有每种1g/L,0.5X含有每种0.5g/L,或0.25X含有每种0.25g/L。在培养48小时后通过离心收获细胞。然后将细胞冷冻干燥并确定干生物质。通过在10%甲醇盐酸中于60°C热处理2小时(同时搅拌)来进行细胞裂解和脂肪酸测定。酯通过气相色谱进行分析以测定脂肪酸成分。表4:不同的盐含量对发酵参数的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>^**)分别三次实验的平均值。通过在上述的含有不同盐浓度的培养基中发酵微生物Ulkeniaxa0sp.2179菌株确定了不添加钠和氯的发酵培养基的最适盐浓度。在这种情况下,每干生物质的DHA含量又是在5%海水盐含量的情况下最高(也参见实施例1)。表示为空间-时间产率的生产率也在该盐含量下获得最适值(参见表4)。实施例4:使用Schizochytriumxa0SR21菌株(Schizochytriumxa0sp.,MYA-1381;EP0823475)在不同的发酵培养基中生产PUFASchizochytriumxa0SR21菌株被培养在含有50ml培养基的300ml带有挡板的锥形烧瓶中(温度:28°C,转速:150rpm)。培养基1:DH1培养基单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]Tropicxa0Marin海盐(g/L):16.65[Dr.Bienerxa0GmbH,Wartenberg,Germany]用HCl将pH值调整到6.0培养基2:DH2培养基(不含盐)单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]用HCl将pH值调整到6.0培养基3:DH3培养基(含有盐补充物,无需添加钠和氯)单水葡萄糖(g/L):56.25酵母提取物(g/L):12.5[Difco]硫酸镁(g/L)1碳酸钙(g/L)1磷酸钾(g/L)1用H₂SO₄将pH值调整到6.0在培养48小时后通过离心收获细胞。然后将细胞冷冻干燥并确定干生物质。通过在10%甲醇盐酸中于60°C热处理2小时(同时搅拌)来进行细胞裂解和脂肪酸测定。酯通过气相色谱进行分析以测定脂肪酸成分。表5:不同的盐含量对发酵参数的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>表6:不同的盐含量对脂肪酸形式的影响ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>本发明中描述的低盐培养基在属于Labyrinthulomycota的其它生物体中也导致了PUFA生产的最适化。因此,在不添加钠和氯的低盐培养基中发酵微生物Schizochytriumxa0sp.SR21菌株是可能的。在这种情况下,相对于干生物质的DHA含量在10%海水盐含量时也有最适值。而且,此时出现了甚至更强的对DHA的空间-时间产率的影响,以及对发酵生产率的影响。在这种情况下,DHA相对于总脂肪酸的含量也略微减少了(参见表6),尽管并没有影响到惊人高的空间-时间DHA产率(参见表5)。构成本发明基础的低盐培养基对于Labyrinthulomycota的不同成员引起了普遍的PUFAs生产的增加。